荧光素酶报告基因实验 第1篇

上期为大家介绍了基因的导入方法，基因导入后对于细胞的影响是我们所更关心的。那么如何检测它从哪些方面影响了细胞的正常功能和代谢呢？在解释这个之前，请回忆在中学时就学到的法则——中心法则。它最早在1958年由Francis Crick提出，后经过完善形成现在我们所熟悉的版本（图1）。

图1 中心法则

中心法则提供了一个框架，帮助更好的理解生物体内携带遗传信息的生物大分子（DNA，RNA和蛋白）是如何将这些信息进行传递的，绝大多数生物均遵循这条法则来进行遗传信息的传递。在整个遗传信息的传递过程主要包括DNA复制（DNA－DNA），RNA复制（RNA－RNA），转录（DNA－RNA），逆转录（RNA－DNA），翻译（RNA－蛋白）这几个过程。那么要研究在设定的实验条件下对细胞的正常功能和状态产生的影响，就可以从中心法则中的这几个节点入手，来进行检测。

第一期介绍细胞生物学实验常用的研究思路和方法中，列出常见的检测节点和方法，可以发现这些检测的内容与中心法则的遗传信息传递流有很多的重合，在这里挑选了一些比较常用的检测内容和方法来进行介绍。这一期主要介绍转录水平检测常用的方法——荧光素酶报告系统。

荧光素酶报告实验由于其快捷、廉价、灵敏度高和可定量等优点，已普遍用于细胞生物学的研究，如基因表达转录水平的研究。荧光素酶报告系统属于生物发光系统，其中的荧光素酶来自于不同生物体内的氧化酶，很多物种（细菌、海洋动物、昆虫等）中都含有荧光素酶，其中应用比较广泛的是荧火虫荧光素酶。它可以在一定条件下与底物发生化学反应产生可检测到的光，产生光的过程中几乎不产生热量，也就是说这个过程中几乎所有的能量全部转化为光能，这使得检测的灵敏度非常高（图2）。下面以报告基因实验（启动子）为例，来介绍双荧光素酶报告系统。

图2 荧光素酶反应原理

报告基因实验常用于研究目的基因的调控元件（启动子、增强子等），调控元件的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。整个报告基因的核心是将待定的调控元件与报告基因进行融合，检测报告基因的表达（图3）。由于报告基因的表达完全取决待定的调控元件，故报告基因的表达量与待定调控元件的活性直接相关。一个好的报告基因必须满足以下条件：

（1）在所检测的细胞内不存在；

（2）检测起来非常方便；

（3）灵敏度要高，最好可以定量。相比于传统的β-半乳糖苷酶（LacZ，真核生物内有内源性干扰）、氯霉素乙酰转移酶（CAT，检测复杂）、荧光蛋白（GFP、YFP、RFP等，灵敏度不高，有些细胞有自发荧光现象），荧光素酶检测系统具有明显的优势。

图3 荧光素酶报告实验图解

由于荧光素酶超级灵敏的能力和宽广的动力学范围，荧光素酶系统得到了广泛的使用。通常荧光素酶的实验会将待检测的调控元件（启动子）安排在荧光素酶基因的上游，构建成载体，然后将构建完成的载体导入到合适的动物细胞中，通过检测荧光素酶的活性来判断调控元件的活性。

在荧光素酶报告系统中，只使用一种荧光素酶（一般为荧火虫荧光素酶），为单荧光素酶报告实验；由于不同的荧光素酶所发出的光具有不同的光谱性质，或使用不同的底物，一个报告实验中也可以使用两种或多种荧光素酶，其中最常用到的就是双荧光素酶（一般为荧火虫荧光素酶和海肾荧光素酶）报告实验，其中一种荧光素酶作为报告基因，另一种则作为内参，主要作用是减少外界因素对于实验数据产生的影响，这些影响主要包括操作误差、细胞接种差异、细胞处理的误差、孔间增殖差异等因素。因此，在调控元件（启动子、增强子）的研究中，双荧光素酶报告实验应用的会更多一些，整个的实验过程也非常的简便，如下图所示（图4）。

图4 荧光素酶报告实验流程

具体的实例可参考文献中的方法，如研究人类PDE7A1启动子转录活性[1]（图5）。

图5 hPDE7A1启动子主要的调控元件检测结果

以上部分就是最常用的研究转录因子调控的检测方法和流程，荧光素酶报告系统在科学研究中的应用非常广泛，下面介绍几个在不同领域应用的实例。

（1） 研究信号转导通路：比如研究p53增加I型主要组织相容性复合物表达的信号通路[2]（图6）。

图6 p53通过ERAP1的反应元件调控其转录

（2）研究microRNA靶标：比如研究与趋化因子CCL20相互作用的microRNA筛选[3]（图7）。

图7 miR-21作用于CCL20的靶位点检测

（3）研究蛋白对RNA的降解作用：比如研究锌指抗病毒蛋白对于小鼠白血病病毒的抗感染作用[4]（图8）。

图8 过表达hZAP抑制XMRV的感染

（4）研究蛋白-蛋白相互作用：比如利用基于双荧光素酶系统的Pull down实验来研究蛋白与蛋白相互作用的相对定量[5]（图9）。

图9 基于荧光素酶报告系统的蛋白相互作用检测

（5）药物筛选：比如核受体药物筛选的相关研究[6]（图10）。

图10 药物与受体结合区结合启动荧光素酶的表达

以上就是本期给大家介绍的内容，我们下期见。

参考文献：

[1] Functional characterization of the human phosphodiesterase 7A1 promoter.

[2] p53 increases MHC class I expression by upregulating the endoplasmic reticulum aminopeptidase ERAP1.

[3] miR-21 functionally interacts with the 30UTR of chemokine CCL20 and down-regulates CCL20 expression in miR-21 transfected colorectal cancer cells.

[4] Zinc-Finger Antiviral Protein Inhibits XMRV Infection.

[5] Relative Quantification of Protein-Protein Interactions Using a Dual Luciferase Reporter Pull-Down Assay System.

[6] Improved Dual-Luciferase Reporter Assays for Nuclear Receptors.

荧光素酶报告基因实验 第2篇

转录因子的 DNA 结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的调控作用。荧光素酶报告基因实验就是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。

荧光素酶（Luciferase）：是能够催化底物氧化发光的一类酶的统称。

荧光素酶的种类很多，其中应用较为广泛的是萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase，FLUC）和海肾荧光素酶（Renilla luciferase，RLUC）

在ATP、Mg2+、O2存在的条件下，虫荧光素在虫荧光素酶的催化下氧化发光，发光颜色为黄绿色。

Luciferase报告基因系统是以荧光素（luciferin）为底物来检测萤火虫荧光素酶（fireflyluciferase）活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin被氧化成oxyluciferin的反应，在luciferin被氧化的过程中会发出生物荧光，然后可以通过仪器测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。

例如，我们想要研究某个转录因子是否能与某一靶启动子片段有作用。

（1）在质粒中，将靶启动子（或其他要研究的基因调控元件）插入到荧光素酶报告基因前方，构建成报告基因质粒。

（2） 将可以表达要检测的转录因子的质粒与报告基因质粒共转染细胞，如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。

（3）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

同时，为了减少内在的变化因素（如：培养细胞的数目和活力的差别，细胞转染和裂解的效率等)对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因(Rinilla luciferase 的质粒(pRL-TK)作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。

在测量过程中，当加入荧光素酶检测试剂Ⅱ(LARII)时产生萤火虫荧光信号，这样先测量萤火虫荧光素酶报告基因。定量萤火虫荧光强度之后，再在同一样品中加入Stop&Glo?试剂，将上述反应淬灭，并同时启动海肾荧光素酶反应，同时进行第二次测量

荧光素酶报告基因的优点

◆蛋白不需要翻译后加工，所以一旦翻译立即产生报告活性。

◆在所有的化学发光反应中，它的光产物具有最高的量子效率，因而非常灵敏。另外，在宿主细胞及检测试剂中均检测不到背景发光。

◆高效，检测快速，每个样品只需几秒钟。

荧光素酶报告基因实验 第3篇

荧光素酶报告基因检测是以荧光素（luciferin）为底物来检测萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光（bioluminescence），可通过荧光测定仪设备测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光，常应用于miRNA靶基因验证及启动子转录活性调控等方向研究。

利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上/下游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。

双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。萤火虫荧光素酶是从甲虫（Photinus pyralis）中分离得到，分子量为61kDa；海肾荧光素酶（Renilla Luciferase）则是从海肾（Renilla reniformis）中分离，分子量为36kDa。

荧光素酶报告基因实验 第4篇

单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。一般情况下，海肾荧光素酶基因作为内参使用，将带有海肾荧光素酶基因的质粒与报告基因质粒共转染细胞；或是将两个报告基因构建到同一个质粒上，分别用不同的启动子启动其表达。计算结果时，将萤火虫荧光素酶的检测值比上海肾荧光素酶检测值（Firefly Luciferase/ Renilla Luciferase），这样就可以减少内在变化因素对实验准确性的影响，相当于做了标准化，使测试结果不受实验条件变化的干扰。

荧光素酶报告基因实验 第5篇

Dual-Luciferase双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶，两者可催化各自的底物发生氧化作用产生生物荧光，以萤火虫萤光素酶为核心reporter，海肾荧光素酶作为内参，构建研究对象到相应位置，转染细胞，裂解细胞，分别加荧光素酶底物，用荧光测定仪检测荧光强度，通过数据得出基因表达量，从而确定构建序列的功能。双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。

将靶基因的转录调控元件或5’启动子区克隆在Firefly luciferase基因的上游，以研究启动子的强弱或转录因子对启动子的作用。与此同时，引入包含Renilla luciferase基因的TK载体作为内参，以便消除细胞转染等因素带来的组间误差。

双荧光素酶报告基因检测系统中的luciferase来源于细菌、萤火虫、发光海洋生物等，可以在哺乳细胞中直接表达，无需表达后修饰，直接具备完全酶活性。与绿色荧光蛋白（GFP）不同，它们的发光检测不需要激发光激发，且发光穿透力更强，这使其具备可定量、高灵敏度及低背景等特点

海肾荧光素酶催化的发光反应需要腔肠素和O2的参与，发光颜色为蓝色。

海肾荧光素酶通常作为内参报告基因，在实验操作的过程中，常遇到由于个人操作造成的实验误差，比如细胞数目不均一、细胞代次不统一、转染效率不一致等。引入一个内参报告基因，以此来标定检测用报告基因的测量结果，从而达到有效地减少实验误差的目的

绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein， GFP)，是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色荧光。

2008年10月8日，日本科学家下村修、美国科学家马丁·查尔菲和钱永健因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年的诺贝尔化学奖。

在细胞生物学与分子生物学中，GFP基因常用做报告基因(reporter gene)。

与传统荧光染料相比，GFP的主要优势在于它无毒，并且可以在活细胞中表达，从而可以研究动态的生理过程。

融合标记：GFP是最常见的用途之一，它可以与蛋白质的N-或C-末端融合，这使科学家能够可视化基因表达的时间和地点。

Reporter：将GFP置于感兴趣的启动子的控制下，可以用来有效地监测特定细胞类型中启动子的基因表达。这种转录报告是GFP最早的应用之一。

纯化：GFP可作为蛋白质纯化的一般表位标记，并可获得大量的GFP商业抗体。

其他：它还被用于在药物筛选中识别特定细胞群，在癌症研究中可视化裸鼠的微转移，充当DNA双链断裂修复的报告员，并标记致病性细胞内微生物，以可视化宿主/病原体相互作用。

其他笔记：

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